微生物转谷氨酰胺酶交联时间对黑水虻幼虫蛋白结构、理化及凝胶特性的影响：一种可持续替代蛋白的质构化策略
日益增长的人口压力和传统蛋白质带来的环境问题，推动了对黑水虻幼虫（BSFL）等可持续替代蛋白用于质构化昆虫基食品的兴趣。然而，BSFL蛋白在食品应用中的利用有限，需要深入了解其结构和功能特性以及加工条件的影响。本研究探讨了微生物转谷氨酰胺酶（MTG）催化交联对
日益增长的人口压力和传统蛋白质带来的环境问题，推动了对黑水虻幼虫（BSFL）等可持续替代蛋白用于质构化昆虫基食品的兴趣。然而，BSFL蛋白在食品应用中的利用有限，需要深入了解其结构和功能特性以及加工条件的影响。本研究探讨了微生物转谷氨酰胺酶（MTG）催化交联对BSFL蛋白结构、理化和凝胶特性的影响。将BSFL蛋白分散液在不同孵育时间（0.5小时至24小时）下处理，以实现不同程度的交联。结果表明，交联度随孵育时间持续增加，在24小时后达到最高水平。BSFL蛋白的渐进式交联增加了粒径，但在长时间孵育（20小时和24小时）后出现了更小尺寸的群体。SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）显示，0.5小时至24小时的MTG处理导致了高分子量聚集体（
250 kDa）的形成。随着孵育时间的增加，巯基含量和表面疏水性逐渐降低，表明MTG诱导的交联导致巯基和疏水残基被包埋在蛋白质网络中。FTIR（傅里叶变换红外光谱）分析显示，经MTG处理的样品表现出更高的β-折叠含量，表明在MTG诱导交联下结构重组为更有序的构象。在功能性方面，20小时的MTG孵育时间使BSFL蛋白质网络获得了最高的凝胶强度和持水性（WHC）。延长孵育至24小时则开始损害凝胶强度和持水性。总体而言，本研究强调了MTG诱导的结构修饰和凝胶机制的时间依赖性。这对于为调控BSFL蛋白的凝胶特性和开发基于BSFL蛋白的质构化昆虫基食品奠定了基础，可推动BSFL蛋白作为可持续替代蛋白的利用。
随着全球人口增长和对传统蛋白质生产环境影响的担忧，寻找可持续的替代蛋白质来源变得日益重要。食用昆虫因其环境足迹低、蛋白质质量高、生长周期快等优点，被视为一种尚未充分开发但前景广阔的蛋白质来源。其中，黑水虻幼虫（BSFL）因其高饲料转化效率、强生存能力和能消化多种有机底物的能力而更具优势，其饲料转化率（FCR）远低于传统禽类、猪肉和牛肉，显示出更高的生物质转化效率。此外，BSFL独特的消化酶和肠道微生物组使其能够利用多种低价值、营养贫乏的有机材料，包括食品加工副产物和一般食物垃圾，这使其成为一种高度可持续的蛋白质来源。目前，BSFL是商业规模上最常饲养的昆虫物种之一，但其应用主要局限于动物饲料生产和作为有机废物管理的生物技术工具。尽管BSFL作为替代蛋白源显示出良好的营养价值和环境可持续性优势，但其在食品中的应用仍处于早期发展阶段，当前努力仅限于实验配方和中试规模研究。
利用包括BSFL在内的昆虫作为功能性蛋白质成分来源是增加其在食品中应用的一个可行策略。然而，对BSFL蛋白的结构和功能特性以及这些特性如何受加工条件影响的了解有限，已成为进一步扩大其应用的主要瓶颈。凝胶化是蛋白质的一项关键功能特性，在许多食品体系中赋予结构和质构方面起着重要作用。然而，BSFL蛋白的凝胶行为在很大程度上仍未得到充分探索，这制约了新型结构化食品的开发。
本研究旨在系统研究MTG在不同孵育时间下对BSFL蛋白结构、理化和凝胶特性的影响。研究假设孵育时间调节蛋白质交联程度，从而影响蛋白质的结构、聚集和凝胶行为。虽然先前的工作表明，使用传统热处理进行BSFL蛋白凝胶化依赖于温度依赖的蛋白质展开和聚集，但本研究的新颖之处在于通过MTG催化的位点特异性ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸共价交联来研究BSFL蛋白的凝胶行为，这是一种在BSFL蛋白中尚未被表征的机制途径。除了为MTG介导的凝胶网络形成相关的结构和物理化学变化提供新见解外，本研究的结果也为未来开发需要更温和加工条件的质构化昆虫基食品提供了有用的参考。
研究人员使用来自马来西亚Life Origins Sdn. Bhd.公司的脱脂BSFL粉末作为原料，通过碱溶-酸沉法提取BSFL蛋白浓缩物。将BSFL蛋白威廉希尔williamhill分散在磷酸盐缓冲液中，制备成两种浓度（2% w/v用于结构和理化分析，10% w/v用于评估凝胶特性）。将微生物转谷氨酰胺酶（MTG）以每克蛋白质5单位的浓度添加到蛋白分散液中，然后在37°C下孵育不同时间（0.5、1、2、4、20和24小时）。孵育结束后，通过立即加热至85°C 5分钟并快速冰浴来终止酶反应。使用动态光散射（DLS）分析粒径和多分散指数（PdI），通过紫外-可见分光光度法测量浊度，使用Zeta电位仪测量Zeta电位，采用邻苯二甲醛（OPA）法测定游离氨基含量以评估交联度。通过Ellmans试剂法测定游离和总巯基（SH）含量，使用ANS荧光探针法测定表面疏水性。通过SDS-PAGE分析分子量分布，使用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析蛋白质二级结构。使用流变仪进行频率扫描测试以评估凝胶的粘弹性，并通过离心法测定持水性（WHC）。所有统计分析均使用SPSS软件进行。
**3.1.1 粒径和PdI**：随着MTG孵育时间的延长，z-平均粒径（强度平均流体动力学直径）逐渐增加，在24小时达到显著高于对照的水平。多分散指数（PdI）也随孵育时间增加而增加，表明粒径分布变宽。体积基准粒径分布显示，在0.5至4小时孵育期间为单峰分布，峰值向更大直径移动；而在20和24小时孵育后，分布转变为双峰模式，出现了新的更小粒径群体，表明长时间孵育导致结构压实和更紧凑聚集体的形成。
**3.1.2 浊度**：在400 nm和600 nm处的吸光度（浊度指标）在所有样品间无显著差异，尽管粒径发生了变化，但可能变化程度不足以显著改变光散射强度。
**3.1.3 Zeta电位**：所有样品的Zeta电位值在-23.26 mV至-27.69 mV之间，且处理间无显著差异，表明MTG交联对BSFL蛋白分子的净表面电荷分布影响最小，静电相互作用在促进MTG存在下BSFL蛋白聚集中的作用不大。
**3.1.4 游离氨基含量**：随着孵育时间从0.5小时增加到24小时，游离氨基含量逐渐降低，表明由于MTG催化的G-L异肽键形成，赖氨酸残基上的游离ε-氨基被持续消耗。交联度从0.5小时的约3.12%增加到24小时的21.57%。
**3.1.5 游离和总巯基含量威廉希尔williamhill**：随着MTG处理时间的延长，游离SH和总SH含量均逐渐下降，在2小时后显著低于对照。总SH的减少量大于游离SH，表明埋藏在蛋白质结构中的SH基团参与了二硫键（SS）的形成。在2小时至24小时的延长孵育期间，SH含量保持稳定，表明能够参与SS键形成的反应性SH基团在2小时时已大部分反应。
**3.1.6 表面疏水性**：表面疏水性随孵育时间增加呈下降趋势，在20和24小时处理后显著低于对照。这归因于交联增加导致更多疏水残基被包埋在聚集体内部。
**3.1.7 蛋白质分子量分布**：SDS-PAGE分析显示，在非还原条件下，MTG处理0.5小时后，对照组中约75 kDa、37 kDa和25 kDa的条带几乎检测不到，而250 kDa的拖尾暗带，表明低分子量蛋白质分子发生了交联，形成了高分子量蛋白质聚集体。还原条件下，这些高分子量暗带变薄，同时较低分子量条带（约37 kDa和
<20 kda）强度增加，表明聚集体部分解离，但顶部仍存在暗带，表明很大一部分聚集体由非还原性键（可能包括mtg交联形成的异肽键）稳定。
**3.1.8 蛋白质二级结构**：FTIR分析显示，β-折叠是所有样品中的主要二级结构。与对照相比，MTG处理0.5小时后β-折叠含量显著增加，同时α-螺旋和β-转角含量减少，表明它们向β-折叠结构转化。孵育时间延长至20小时对二级结构影响最小，结构相对稳定。然而，在24小时孵育后，无规卷曲含量显著增加，同时β-折叠含量（不显著）减少，表明过度交联可能部分破坏了有序结构。
**3.2.1 频率扫描**：所有样品的储能模量（G′）均随频率增加而增加。对照和短时间（0.5-4小时）MTG处理样品的G′-频率曲线小时处理样品的曲线斜率相对平坦，表明后者形成的蛋白质网络频率依赖性较低。通过幂律模型拟合得到的频率指数n值在20和24小时处理后显著低于对照，表明凝胶从高度频率依赖的粘性主导状态转变为弹性主导的稳定凝胶结构。幂律常数k值（代表凝胶强度）在20和24小时后显著高于对照，但24小时样品的k值显著低于20小时样品。在1 Hz参考频率下，G′值从对照的16 Pa持续增加到20小时处理后的327 Pa（20倍），但在24小时下降至185 Pa，表明过度交联开始削弱凝胶网络结构。
**3.2.2 持水性**：MTG催化形成的BSFL蛋白质网络的持水性（WHC）显著提高（约三倍）。20小时处理样品的WHC最高（91.51%），24小时处理样品略有下降（87.14%），表明适度交联最有利于保持凝胶网络中的水分。
综合本研究结果，提出了一个多阶段机制来解释MTG孵育时间对BSFL蛋白凝胶行为的影响。
**早期阶段（0.5-4小时）**：BSFL蛋白快速聚集，粒径增加，SDS-PAGE显示形成高分子量聚合物。游离氨基含量减少证实了MTG催化交联的发生，此期间交联度约为3-6%。FTIR显示β-折叠含量在0.5小时即增加，表明MTG处理诱导了分子间相互作用和结构重组为稳定的二级结构。同时，MTG交联过程可能使SH基团更接近并促进SS键形成，游离和总SH含量在2小时后显著减少。MTG催化的异肽键构成网络的主要骨架，SS键则通过额外的共价交联进一步致密化和稳定蛋白质网络。
**长时间孵育阶段（20-24小时）**：交联度增加至约10-21%，导致显著的结构重组。粒径分布从单峰变为双峰，出现了新的更小、更紧凑的聚集体群体，这可能是由于分子内交联增加导致蛋白质更紧密折叠。在20小时时，凝胶表现出最低的频率依赖性、最高的弹性和最高的WHC，表明此时形成了既能抵抗形变又能弹性恢复并能有效持水的网络。在24小时时，尽管交联度最高（21%），但凝胶强度和WHC均低于20小时样品，表明过度交联导致网络过于刚性且脆，缺乏弹性形变所需的柔性，同时过度交联可能部分破坏了有序的二级结构（无规卷曲增加，β-折叠减少），削弱了氢键对结构完整性的贡献。因此，20小时代表了本研究条件下的最佳MTG孵育时间。
本研究系统研究了MTG交联对BSFL蛋白结构、理化和凝胶特性的影响。延长MTG孵育时间促进了聚集体生长，但长时间孵育（20-24小时）导致了更小粒径群体的出现，表明聚集体内部发生结构压实。更长的孵育时间也增加了异肽键的形成，产生了更高的交联水平。24小时后达到最大交联度（约21.6%）。SH含量和表面疏水性的变化表明，MTG催化交联诱导了结构修饰，SS键和疏水相互作用有助于网络稳定性。二级结构分析表明，结构重组为富含β-折叠的构象发生在孵育0.5小时内，而延长处理主要通过靶向交联强化现有结构，而非广泛的二级结构变化。在功能上，MTG处理在孵育20和24小时后显著提高了凝胶强度，产生了具有高持水性的更接近固体状的弱凝胶。最大凝胶强度出现在20小时，之后在24小时凝胶结构开始减弱，这突出了MTG介导的凝胶机制的时间依赖性。这些发现为BSFL蛋白在MTG应用下如何进行结构修饰、聚集和凝胶化提供了新的机制见解，也为未来开发基于BSFL的质构化食品产品提供了科学依据。
需要注意的是，BSFL蛋白浓缩物中残留的非蛋白质成分（如脂质和几丁质等碳水化合物）可能影响凝胶行为和持水性。虽然这些成分不直接参与蛋白质交联，但它们可能作为被动填充物干扰蛋白质-蛋白质相互作用。由于研究其具体影响超出了本研究的范围，建议未来工作使用高度纯化的BSFL蛋白分离物，以解耦这些非蛋白质成分的贡献。